高灵敏度 InGaAs 相机 C-RED 2：红外二区小动物活体成像全流程应用

▌红外II区活体成像

临床前动物模型中的体内分子成像是更好地理解生理机制的关键。在过去的几十年里，第一个生物窗口（红外Ⅰ区，700-900nm）的荧光已被广泛用于这一目的。由于吸收和散射减少，红外I区荧光穿透力大于可见光（参见图1（A））。然而，在这个波长范围内，对于深度超过几毫米的信号，图像分辨率和灵敏度较差。这是由于荧光激发波长（通常为700nm）的穿透性较差造成的。

在第二个生物窗口中进一步向红外成像有几个优点[1-3]：

• 发射光谱在红外II区的荧光染剂可以用具有最佳穿透力的红外Ⅰ区的波长激发（图1（B））。

• 散射和吸收在第二个生物窗口相对更弱（图1（A））。

• 生物组织自发荧光相对较弱，这使得信号相对于背景信号的信噪比大幅提升。

因此，红外II区成像（1000-1700nm）相对可见光或红外Ⅰ区荧光，具有更好的空间分辨率、穿透深度和对比度。这种应用正成为临床前[1,4]和临床研究[5]的关键参与者。

▲ 图1-（A）生物组织中的光学窗口。在第一和第二红外窗口中，血液和组织的吸收和散射被最小化，从而使光更容易穿透。（B） 在第一和第二窗口中成像的穿透光 谱，箭头指向通常用于激发的波长。

研究结果表明，红外Ⅰ区成像中使用的一些造影剂在红外II区光谱范围内有可使用的发射光谱尾端（图2（B））。吲哚菁绿（ICG）是一种生物兼容且FDA批准的造影剂，通常用于红外Ⅰ区和红外II区荧光成像[6,7]。

用于可见光和红外Ⅰ区成像的硅基相机在红外II区范围内不敏感（图2（A））。红外II区城乡通常需要基于InGaAs传感器并在短波红外区域（900-1700 nm）敏感的特定相机。C-RED 2是First Light Imaging开发的640×512像元数的 InGaAs阵列相机，将红外II区高灵敏度与高帧率相结合，实现了灵敏的动态成像。

▲图2-（A）基于硅（Si）和铟镓砷（InGaAs）传感器的典型相机的灵敏度曲线。基于InGaAs的传感器最适合在第二生物窗口中成像。（B） 吲哚菁绿的荧光激发发射 谱。

注释：第二生物窗口（红外II区）成像可达到更大的穿透深度及更高的空间分辨率

▌利用C-RED2进行红外II区成像

红外临床前成像仪

小动物成像实验大多使用类似的实验装置。主要元件是用于样本（小鼠）的载物台、用于荧光激发的激光源和成像设备，该成像设备包括物镜、一组发射滤光片和用于检测荧光的相机。对于下文所述的结果，C-RED 2相机安装在现有的短波红外成像装置中。激发源是808nm激光器，其提供120mW/cm2的照明。发射滤光片是高通短波红外窗口滤光片。临床前成像设备由OPTIMAL Grenoble建立。

▲图3-实验中使用的成像系统的示意图。

动物模型和方法

将一只六周大的雌性裸鼠（Janvier Labs）麻醉，并在尾部静脉注射500µmol/L的ICG（塞尔维亚实验室）。注射后t0至t+40s拍摄了视频。然后，采集了耳朵注射后15分钟的放大图像以及ICG在耳朵中的生物分布的延时图。实时体内成像实验由OPTIMAL Grenoble进行。

实验结果

静脉注射ICG后，对小鼠全身进行体内红外II区成像提供了ICG在所有器官中的生物分布图。后肢脉管系统、器官、血管系统和股血管清晰可见。请注意图像的低自发荧光和高对比度。下图突出显示了一些关键器官。采集参数为：10ms积分时间、100FPS、高增益、CDS模式。对比度反转，但未进行后处理。

▲图4-红外II区小鼠全身的荧光体内成像。血管网络可以以高对比度看到。反转和自动缩放对比度。

下图（参见图5）集中拍摄小鼠腹部，突出了系统在对比度和分辨率方面的性能。轮廓上图片的窄度说明了血管的高空间分辨率，而图片的信噪比说明了信号与背景的比率。

▲图5——小鼠全身的红外II区荧光图像（左）和沿紫色虚线的横截面荧光强度分布（右）。 

使用更高放大倍数的镜头可以获得特定感兴趣区域的更详细视图。下面显示的是耳朵脉管系统的示例。采集参数为：500 ms积分时间，2 FPS，高增益，CDS模式。对比度被反转，但没有进行后处理。请注意，高信噪比和信号背景比可以使皮肤和皮下血管可视化。例如，在制药应用中，这将允许非侵入性地研究由致敏材料诱导的血管反应。

▲图6-红外II区外耳脉管系统的荧光体内成像。反转对比度

精心设计的成像系统优化了对比度和分辨率。C-RED 2中可用的增益和偏差实时校正可实现高质量图像的实时可视化。可以精确地研究荧光标记的生物分布。

活体动态成像

C-RED 2的高灵敏度能够在较低积分时间检测更加微弱的荧光信号，因此采集帧率可以更高。C-RED 2是市场上速度较快的红外II区InGaAs阵列相机，能够在全帧模式下以高达600 FPS的速度运行，读噪声小于30个电子，使得使用者可以优化时间分辨率，得到精确的动态成像，从而监测小鼠的新陈代谢。 

First Light Vision GUI支持连续采集8000多帧（使用标准计算机），这些图像可以保存为六种不同的格式，包括.raw、.tiff和.avi等。“直接录制”选项允许动态保存图像并获取更长时长的视频。另外，C-RED 2相机也可以与MatLab、LabView等联用。

裸小鼠注射ICG，在高增益模式下拍摄的40秒视频，5毫秒的积分时间（200 FPS）。请访问First Light Imaging网站以观看完整的视频。

▲图7-ICG在小鼠尾静脉注射后的生物分布红外II区荧光成像。40秒时长的视频截图，展示了ICG的扩散。色彩代码图像，不同颜色显示不同荧光强度。

可以清楚地看到ICG在肝脏中的积聚，以及心脏和肺部的收缩。随着药物的扩散，小鼠全身血管化变得更加明显。

在第一次注射后10分钟，进行第二次静脉ICG注射，并在高增益模式下以50ms的积分时间（20FPS）采集了时长1分钟的第二个视频。请访问First Light Imaging网站以观看完整的视频。

▲图8-在耳内静脉注射ICG后生物分布的红外II区荧光成像。60秒时长的视频截图，展示了ICG的扩散。色彩代码图像，不同颜色显示不同荧光强度。

当ICG通过血管扩散时，耳朵微血管化变浅。

C-RED 2的高灵敏度使短积分时间变成可能。该相机具有市场上最高的全幅帧率（600 FPS全帧），可达到非常高的时间分辨率。

数据分析

C-RED 2的高灵敏度与高帧率相结合，可实现荧光信号的高时间分辨率。生理参数，如生命体征（心率和呼吸率）、造影剂积聚、代谢率等，可以在体内实时动态监测。 

精确评估生物动力学

荧光信号动力学可以通过特定区域的荧光强度随时间变化来研究（图9）。ICG在不同器官中的分布可以及时追踪。请注意ICG如何在肝脏中积累。对动力学的精确评估进一步实现了无接触和非侵入性测量。

▲图9：生理参数的时间监测图。六个感兴趣区域的40秒时间曲线。

非侵入性和非接触式监测

▲图10：生理参数的时间监测。两个感兴趣区域的5秒时间曲线。注射后的时间以秒为单位。

注意其他感兴趣区域的荧光强度是如何与呼吸速率同步的。

▲图11-生理参数的时间监测。四个感兴趣区域的5秒时间曲线。注射后的时间以秒为单位。

C-RED 2能够对生物参数进行定量延时分析。 

▌为什么选择C-RED2来进行临床前成像研究

• 易于集成。相机底部、侧面或正面有安装螺孔，相机可以很容易地集成到系统中，标配C口适配器，可接各种标准C口镜头。First Light Vision GUI使C-RED 2成为一款即插即用型相机，得益于多功能SDK，该相机可以与MatLab、LabView等接口连接。

• 特殊视频模式。图像缓冲区的大容量允许使用获取更长时间的视频，我们的特殊功能“直接录制”允许动态保存图像并获取无限长的视频，限制只存在计算机的容量上。

• 高灵敏度。由于其低读出噪声<30e-和优化的暗电流600e-/pix/s（在-40°C下），C-RED 2非常灵敏，能够检测到非常微弱的信号。

• 针对长曝光时间进行了优化。热电冷却与空气（风扇）和水冷却相结合，可将相机冷却至-40°C。此外，对于长曝光时间，可以优化采集设置。

• 即时修正。可以实时执行偏差和增益校正。

• 简化实验。对于具有多种设置的复杂实验，相机中最多可以保存十个预设配置，以便在配置之间快速切换。

C-RED 2是一款即插即用的相机。C-RED系列相机提供图像硬件优化，以适应您的特定用例。 

▌结论

体内实时微血管系统的可视化提高了我们对循环系统（血管解剖、血流等）和相关病理的理解。以非侵入性和高时间精度监测心率和呼吸率等生理参数也是可能的。这些是生物医学红外II区成像多种应用中的一部分，其他还包括肿瘤可视化、药物开发等。

本说明中描述的C-RED 2的完整实验说明了其在小动物成像方面的性能。可以对拥有完整皮肤小鼠的血管化系统进行高对比度成像。此外，高时间分辨率的视频表明，我们能够精确地绘制生物动力学图。

C-RED 2是一款先进的相机，专为高要求的短波红外应用而设计。C-RED 2功能多样，能够在长曝光时间、极快的帧率（高达600 FPS）和短积分时间内实现高质量传感。因此，C-RED 2非常灵活，非常适合小动物成像。

First Light Imaging感谢Optimal Grenoble组装临床前成像设备并进行体内实验。

▌参考文献

1.  Zhu, S.; Yung, B. C.; Chandra, S.; Niu, G.; Antaris, A. L.; Chen, X. Near-Infrared-II (NIR-II) Bioimaging via Off-Peak NIR-I Fluorescence Emission. Theranostics 2018, 8 (15), 4141–4151. https://doi.org/10.7150/thno.27995.

2.  Bhavane, R.; Starosolski, Z.; Stupin, I.; Ghaghada, K. B.; Annapragada, A. NIR-II Fluorescence Imaging Using Indocyanine Green Nanoparticles. Sci. Rep. 2018, 8 (1), 14455. https://doi.org/10.1038/s41598-018-32754-y.

7.      Carr, J. A.; Franke, D.; Caram, J. R.; Perkinson, C. F.; Saif, M.; Askoxylakis, V.; Datta, M.; Fukumura, D.; Jain, R. K.; Bawendi, M. G.; Bruns, O. T. Shortwave Infrared Fluorescence Imaging with the Clinically Approved Near-Infrared Dye Indocyanine Green. Proc. Natl. Acad. Sci. 2018, 115 (17), 4465–4470. https://doi.org/10.1073/pnas.1718917115.

*本篇技术应用原文出自牛津仪器科技(上海)有限公司。

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